“流浪CTC”的“转移发动机”：等你来盘！
探索循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤转移中相关分子机制对于研究肿瘤发生发展具有重大意义。
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文献来源：Lu-Nan Qi, Bang-De Xiang, Fei-Xiang Wu, et al. Circulating tumor cells undergoing EMT provide a metric for diagnosis and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma.Cancer Res 2018; 78(16): 4731–44.
循环肿瘤细胞（CTC）上皮间质转化（EMT）动态监测：HCC诊断和预后评估新手段
NO.1
摘要
1. CTC检测方法：CanPatrol®技术 。
2. CTC阳性率：90.18%（101/112），早期患者也可检出CTC。
3. 复发/转移临床预测值：CTC总数≥16，间质型CTC所占比例≥2%。
4. 临床观察发现术后CTC总数↑、间质型CTC所占比例持续↑的HCC患者更易出现复发。
5. BCAT1基因的筛选路径：对CTC总数高和间质型CTC所占比例高的HCC组织进行分析，鉴别出表达上调的67个肿瘤相关基因，其中BCAT1基因表达水平明显升高。
6. BCAT1基因的后续基础研究：BCAT1基因沉默细胞系的增殖、迁移和侵袭能力降低。同时出现上皮标志物表达水平增高，间质标志物表达水平下调，提示BCAT1可能参与了EMT。
7. 主要结论
- CTC是预测HCC早期复发和预后评估的新型标志物。
- BCAT1基因过表达可能通过激活EMT从而促进CTC的释放。
- 间质型CTC和BACT1基因是预测肝癌转移的新型标志物。
NO.2
研究介绍
1. 肝癌容易复发和转移，但临床缺乏准确实时的评估手段
- 传统的HCC影像学检查和病理分期的准确性相对较低
- 影像学发现新病灶时，肝癌已复发或转移
- 微血管侵犯和脉管癌栓常在手术时才被发现
2. CTC是实体恶性肿瘤远处转移的关键，具有重要临床价值
- CTC可用于预后评估、治疗疗效评价
- 根据是否发生上皮间质转化（EMT），CTC分上皮型CTC、间质型CTC、混合型CTC
- HCC研究发现：发生EMT的CTC所占比例变化与疾病进展相关
3. CTC检测技术分析
- 常见CTC分离技术为物理分离或生物分选，基于细胞表面抗原的生物分选无法检出发生EMT的CTC类型
- CanPatrol®CTC检测技术被陆续报道，该技术使用上皮-间质转化相关标记物，将CTC分为三种类型，上皮标志物：EpCAM、E-cadherin、CK8、CK18、CK19，间质标志物：Vimentin、Twist，与其他技术相比，CanPatrol TM分离效率高，并能检测多种类型CTC，目前该技术已应用于多种类型的实体恶性肿瘤。
4.本研究创新点
- 本研究使用CanPatrol®技术来分离和鉴定不同类型的CTC
- 本研究探讨了不同CTC类型与患者特征及临床预后之间的相关性
- 本研究通过基因表达分析鉴定出可能参与CTC释放的关键基因，从而为CTC相关分子机制提供更多信息
NO.3
患者和方法
1. 患者与样本
- 患者数量：2014年3月至2016年8月，在广西肿瘤医院进行R0切除的112名HCC患者。
- 患者入组标准：(i) Child–Pugh A分期，PST 分数0–1；(ii)根据WHO标准病理诊断明确为HCC (iii)R0切除定义为：肉眼可见的肿瘤完全切除，手术切缘阴性，无肝内和肝外转移病灶；(iv)未接受过抗肿瘤治疗。肿瘤分期标准为BCLC分期，肿瘤分化采用Edmondson评分系统。
- 对照组：20名健康人和12名HBV感染的患者。
- 随访终点：2017年5月31日。
- 其他：遵守相关临床试验伦理要求。
2. CTC检测方法：CanPatrol®
- 采血时间点：手术前1-2天，手术后平均9天（范围为手术后8-10天）。
- 采血容器：5ml EDTA抗凝管。
- 最初采集的2ml丢弃，以避免静脉穿刺时的皮肤细胞潜在污染。
- CTC分离: 过滤装置包括8-um孔径的纳米滤膜（Surexam），含阀门装置的真空歧管（Surexam），真空抽滤泵(Auto Science)。CTC分离前使用红细胞裂解液去除红细胞，含4%多聚甲醛的PBS悬浮液固定5分钟，过滤时负压为0.08MPa。
- CTC鉴定：核酸原位杂交（RNA-ISH）的特异性靶向探针（Surexam）有：CD45 (白细胞标志物), EpCAM、CK8/18/19(上皮型标志物), vimentin, and Twist (间质型标志物)。使用DAPI染色进行核型分析。最终在荧光显微镜下观察。
3. CTCs的DNA提取纯化与p53基因R249S突变分析
流程：采用显微切割仪（型号PALM MicroBeam，Zeiss）获取目标CTCs—目标细胞在15ul lysis buffer缓冲液 (10 mmol/L Tris–HCl, pH8 and 200 mg/mL proteinase K)52度孵育过夜—梯度离心10,000 g，5min—全基因组扩增（试剂Sigma-Aldrich）。
4. RNA提取纯化，基因芯片杂交和数据分析
5. 半定量RT-PCR，实时定量PCR（qPCR）和Western-blotting
6. HepG2，Hep3B和Huh7细胞系的BCAT1基因沉默
7. 细胞增殖分析
8. 流式细胞技术分析细胞凋亡
9. 细胞迁移和侵袭分析
- Transwell迁移实验（8-mm pore）。
- 侵袭实验（同Matrigel侵袭试验，除外Matrigel，18h孵育和甲醇固定）。
10. 数据统计
- 患者特征描述：分类变量为数量和所占比例，连续变量为均值+标准差和范围（最小值，最大值）。
- 非正态分布的组间比较：Kruskall–Wallistests,pair-wise comparisons,Mann–Whitney U test。
- 单因素和多因素Cox回归分析用于分析患者特征与HCC复发相关性，单因素Cox-regression分析中具有统计学意义的变量(P
- ROC受试曲线分析（最大约登指数）用于明确与复发相关的cutoff值：术前CTC数量和间质型CTC所占比例。
- Pearson χ2 tests或Fisher exact tests用于分析CTC总数和间质型CTC所占比例（以最优cutoff值分类）与早期复发之间的相关性。
- Kaplan–Meier curve with alog-rank test用于分析CTC总数变化或间质型CTC所占比例变化与术后无肿瘤生存时间的相关性。
NO.4
研究结果
1. 患者特征
患者特征总结在表S3中。 共招募了112名R0切除的HCC患者（92名男性和20名女性），平均年龄为47.1岁（范围：20-72岁）。在这些患者中，11例（9.8％）为BCLC 0期，44例（39.3％）BCLC期A期，24例（21.4％）BCLC期B期，33例（29.5％）BCLC期C期。
2. 所有HCC患者与对照组人群外周血中的CTC亚型分析
使用CanPatrol®技术进行CTC分离和鉴定分型，在外周血中检出许多CTC。红色荧光代表上皮标志物相关基因表达，绿色荧光代表间质标志物相关基因表达，白色荧光代表白细胞标志物CD45基因表达（图1B）。
图1B：基于EMT标志物的CTC鉴定与分型
为了验证这些CTC来自原发性HCC而非其他组织，我们进一步分析了5位患者，这5位患者均在原发肿瘤组织检出P53基因R249S突变（4例AGGArg→AGTSer突变，1例AGGArg→AGCSer突变），癌旁组织未检出此突变。我们在这五位患者CTCs的DNA中检出相同的R249S突变，这证实CTC起源于原发肿瘤病灶而非其其他部位（图1C，见下）。
图1D：HCC患者体内分离鉴定的CTC代表图片
红色荧光为上皮标志物（E），绿色荧光为间质标志物（M）
图1E：HBV感染患者和健康受试者的CTC总数（上）
及不同型别CTC检出所占比例（下）
图1F：BCLC 0–A期和B–C期HCC的CTC总数（上）
及不同型别CTC检出所占比例（下）
图1G：CTC阳性的HBV感染患者1在检测5个月后发现两个HCC小病灶
3. 术前CTC总数和不同型别CTC所占比例的预后评估价值
我们首先分析了CTC数量和BCLC分期的相关性。BCLC 0-A期的CTC阳性率为83.6％（46/55），BCLC B-C期的CTC的阳性率为96.5％（55/57）。CTC总数中位数和间质型CTC所占比例中位数：晚期HCC>早期肝癌（P
BCLC分期0-A期和B-C期患者的复发率分别为69.1％（38/55）和92.9％（53/57）。
表1显示了术前临床病理特征与HCC术后复发的相关性（单因素和多因素Cox回归分析，见下）。单因素分析显示：HCC术后复发可能与AFP水平、肝硬化、肿瘤大小、BCLC分期、淋巴结转移数量、微血管侵犯（MVI）、门静脉癌栓（PVTT）、肿瘤包膜、CTC总数、间质型CTC所占比例、间质>上皮混合型CTC所占比例有关（上述均P
约登指数最大化的最佳cutoff值：CTC总数为16，间质型CTC所占比例为2％（CTC总数：敏感性55.3％，特异性92.3％; 间质型CTC所占比例：敏感性80.9％，特异性69.2％）。
在早期复发的患者中，肝内多复发病灶同时伴肺转移的患者所占比例为34.0％，单纯肺转移的所占比例为21.3％，肝内多复发病灶的所占比例为14.9％。在晚期复发的患者中，大部分为肝内单个复发灶（70.5%）和肝内多个复发灶（22.7％）。此外，CTC总数≥16的患者比CTC总数
4. 术后CTC总数和不同亚型CTC所占比例变化及其预后价值
术后CTC检测时间：切除手术后8-10天
上皮型CTCs和混合型CTCs所占比例下降，但间质型CTC所占比例上升。
其中CTC总数（P
log-rank tests分析显示：间质型CTC所占比例与肿瘤无进展生存率密切相关（P=0.033），CTC总数无此相关性。
10名患者的术后CTC动态监测有效预警了肿瘤的复发与转移：8名患者在复发或转移发生前1-2个月出现CTC总数升高，6名患者在复发转移前出现间质型CTC所占比例的升高。
图G：1名患者在R0切除术后4个月出现肝内多复发灶，CTC总数提前2个月实现预警
5. 高CTC水平与低CTC水平的HCC基因表达谱差异
为了透彻地研究CTC相关分子机制，我们对CTC水平具有显著差异的25名HCC患者进行了基因表达谱分析，这25名患者为：
- 组1：15名高CTC水平的患者，标准为：CTC总数≥21并且间质型CTC所占比例≥5%
- 组2：10名低CTC水平的患者，标准为：CTC总数≤5并且间质型CTC所占比例为0
具有统计学意义，并且表达水平在组1和组2之间具有显著差异（≥2倍）的一批基因被筛选出来。在高水平CTC的HCC，共计发现187个上调基因和57个下调基因。
进一步使用ClusterProfiler Package (R/bioconductor; http://www.bioconductor.org/), KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis分析后发现10项KEGG pathways clusters。其中不同基因表达量中，排名第一的是：Pathways in cancer。肿瘤信号通路共计包括9个信号通路，例如Wnt, FAK, 和PI3K–AKT信号通路。
共计67个肿瘤相关基因的表达在高水平HCC和低水平CTC的HCC具有差异化表达（48个上调基因和19个下调基因）(图4C). 进一步使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA; http://www.Ingenuity.com)对这67个基因进行相关生物学过程的分类，分析发现这些基因在七种肿瘤相关生物学过程中发挥作用（例如细胞粘附和侵袭、肿瘤血管生成、凋亡）。
在67个差异化表达的肿瘤相关基因中，BCAT1基因表达显著升高（13.31倍，P
图4C 67个肿瘤相关基因的表达在高水平HCC和低水平CTC的HCC具有差异化表达（48个上调基因和19个下调基因）
进一步通过RT-PCR，qPCR和Western印迹技术分别确认了112例样本的BCAT1表达上调，并将患者分为3组：
- 第1组：CTC总数≥16，并且间质型CTC所占比例≥2％，n = 25
- 第2组：CTC总数≥16或间质型CTC所占比例≥2％，n = 39
- 第3组：CTC总数
RT-PCR和Western印迹技术典型结果见下图
进一步运用RNA原位杂交技术在112位患者的79位中验证了BACT1基因的RNA表达。
6. BCAT1过表达可能通过激活EMT诱导HCC增殖、侵袭和转移，并抑制凋亡
我们对BCAT1中高表达的Hepg2, Hep3B, Huh7细胞系进行BCAT基因沉默，并分析HCC增殖、凋亡和侵袭。与阴性对照组相比，shRNA-BCAT1沉默克隆（sh-1，sh-2）的BCAT1表达降低。此外，在RES组，BCAT1基因表达水平有效恢复。因此上述细胞系被选择用于后续分析。
BCAT1表达下调可显著抑制HepG2，Hep3B和Huh7细胞系增殖。
使用CCK8试验在不同时间点评估shRNA-BCAT1沉默克隆（sh-1，sh-2）的增殖能力。
本研究还进一步探索了BCAT1表达下调是否会影响HCC细胞的上皮-间质转化。qPCR检测结果显示：与对照相比，Sh-BCAT1组中E-cadherin的mRNA水平显著增加。与对照相比， Sh1-BCAT1组、Sh2-BCAT1组的HepG2和Huh7细胞系中EpCAM的mRNA水平也显著增加。
与此相反，与对照相比，Sh-BCAT1组中间质标志物vimentin和Twist 的mRNA表达水平均显著降低。
NO.5
讨论
1. 创新性运用canpatrol®技术检出所有类型CTCs，包括发生EMT的CTC
由于CTC能反映实体恶性肿瘤的侵袭和转移能力，许多研究致力于可靠有效地捕获和鉴定循环肿瘤细胞。尽管Cellsearch技术已有大量研究报导，该技术通过肿瘤上皮细胞标志物EpCAM阳性表达、细胞核完整、CD45表达阴性来鉴定CTC。但cellsearch无法检出发生上皮-间质转化的CTC，例如间质型CTC。因此，我们创新性采用了通过上皮和间质标志物进行鉴定的CTC检测技术CanPatrol®。
2. CTC检测为HCC高危人群的早期筛查和早期诊断提供了新方法
HCC患者的CTC检测阳性率为90.18%，其中超过一半的患者为早期HCC患者（BCLC 0–A 期），这说明肿瘤细胞的播散是HCC发生的早期事件。令人意外的是，我们在12位HBV感染患者中的2位患者检出了较低水平的CTC，这两位患者在后续随访的5个月内均出现了CT/MRI可测量的HCC小病灶。这与之前研究发现原发病灶被发现前就可能就存在微转移灶的结论是一致的。之前有研究表明，慢性阻塞性肺疾病患者中有少数人可检测出CTCs，对这些CTCs阳性患者后续每年进行随访，并进行CT扫描后发现，这些CTC阳性患者在CTC检出后1-4年均最终诊断为早期肺癌。由于HBV感染最终可发展为HCC，HBV感染患者检出CTCs可能表明体内存在无法检出的、非常早期的肿瘤。因此，对于HCC高危患者（例如HBV感染或者肝硬化），CTC检测可能是肝癌微小病灶早期诊断的重要方法。需要进一步深入研究，探索CTCs检测在HCC高危人群中的早期诊断价值和临床意义。
3. CTC总数≥16或间质型CTC所占比例≥2％的患者更易出现术后早期复发（6个月内）
HCC复发是肝癌预后的重要因素，但复发时间和复发模式因人而异。已有研究表明，混合型CTC可能预测肝内转移，间质型CTC可能提示肝外转移。在本研究中，多因素分析显示：CTC总数和间质型CTC所占比例可预测HCC术后复发。ROC分析显示：CTC总数=16和间质型CTC所占比例=2%预测术后6个月的早期复发具有最佳的灵敏度和特异性。此外，CTC总数≥16，且间质型CTC所占比例≥2％的患者更容易出现肝内多复发灶和肺转移，这提示肝内多灶复发和肺转移可能由CTC引起。因此，CTC总数≥16或间质型CTC所占比例≥2％可有效预测早期复发及其复发模式（例如肝内多复发灶和/或肺转移）。除外CTC，肝硬化、HBV感染都是HCC肝内单复发病灶的危险因素。已有研究提示：大多数根治性切除术后的晚期复发病灶可能并非来自原发肿瘤，而是由HBV引起肝硬化形成的新肿瘤病灶。这与本研究发现晚期复发的模式主要是肝内单复发灶的现象相吻合。
4. 间质型CTC所占比例升高与术后复发风险增加、无疾病生存期相对缩短相关
CTC动态监测在肿瘤治疗中的应用价值已经在多种其他类型的恶性肿瘤陆续报道。已有研究观察发现：HCC切除术后CTC数量可显著下降，术后CTC数量无法降低至2个以下CTC的患者更容易出现术后复发。与此相反，此研究并未发现CTC数量变化与复发率的相关性，也未发现CTC数量变化与复发时间的相关性，尽管超过一半的患者均在HCC切除术后8-10天出现CTC数量迅速下降。目前还无法对此现象作出合理解释。肿瘤手术切除过程中对肿瘤的机械性挤压可能造成肿瘤细胞进入血液，因此术后早期会出现CTC数量的增多。但这些细胞可能缺乏生存能力，不会最终造成早期复发。因此，术后8-10天的CTC数量变化可能无法准确反映手术治疗效果。但是，间质型CTC所占比例升高的HCC患者更容易出现复发，并且无疾病生存期相对缩短，这可能与BCAT1过表达诱导的EMT相关。
5. 术后CTC动态监测比传统影像学检查提前1-2个月发现HCC复发/转移
我们在研究中发现：10名术后CTCs数量增多的患者在1-2个月后均发生了临床可检测到的复发病灶。CTC增高的原因还不清楚，因为CTC在从原发肿瘤病灶脱落进入血液后发生自我增殖的相关研究还未见报导。有研究者认为：CTCs的存在可能与其他活性增殖的转移病灶有关，也可能来自临床无法检测到的转移病灶。正如我们之前提到的：肿瘤细胞播散可能是HCC发生发展过程中的早期事件，因此转移灶可能在被临床影像学检查发现以前就释放肿瘤细胞进入血液循环。综上所述，术后动态监测CTC比传统的影像学检查方法（超声检查和CT）更早预测了复发。
6. 基因表达谱分析：CTC最相关的差异化表达来自肿瘤信号通路，与转移密切相关
通过分析极高CTC水平和极低CTC水平的HCC基因表达谱发现：肿瘤信号通路相关基因的表达水平具有最大差异。67个肿瘤相关基因被发现在7种肿瘤相关生物学过程中发挥重要作用，包括与转移密切相关的生物学过程，如细胞侵袭和迁移的正向调节，肿瘤血管生成、细胞凋亡的负向调控。我们还发现大部分与转移相关的基因发生表达上调。与此相反，正向调控凋亡的相关基因则表达下调，如DSG1, SLC38A11和SLC10A1。因此，HCC可能存在某些补偿性的播散/转移机制，从而导致CTC数量增高，间质型CTC所占比例增高。
7. BCAT1在间质型CTCs的阳性表达可能增强CTCs的侵袭和抗凋亡能力
BCAT1基因是在高CTC数量和高间质型CTC所占比例的HCC中筛选出的67个表达上调肿瘤相关基因中之一。BCAT1基因在CTCs的阳性表达率为86.52%，在间质型CTC为91.08%。BCAT1基因位于12p12.1，编码负责催化α-支链酮酸与L-支链氨基酸之间可逆转化的转氨酶，与细胞生长密切相关。已有研究表明，BCAT1基因与细胞增殖、分化、凋亡密切相关，并参与了多种恶性肿瘤的发生发展。我们研究发现：Hepg2, Hep3B,和Huh7细胞系进行BCAT基因沉默后，迁移和侵袭能力下降，由于这些细胞系同时发生了上皮标志物（(EpCAM、E-cadherin)表达上调，间质标志物(vimentin、Twist)表达下调，因此BACT1基因沉默细胞的迁移和转移能力下降可能与EMT被抑制有关。除此外，BCAT1基因沉默还能显著降低细胞增殖能力，并促进细胞凋亡。因此，CTCs的BCAT1过表达可能增强了了肿瘤细胞的侵袭能力和抗凋亡能力。研究中我们发现：术前间质型CTC所占比例高，以及术后间质型CTC所占比例增高的患者更容易出现早期复发，这可能与大部分间质型CTCs均表达有BCAT1基因相关。
8. CTC总数≥16个且主要是上皮型CTCs患者复发时间相对更短，可能与EpCAM有关
已有研究认为EpCAM是一个肿瘤干细胞标志物，EpCAM阳性的CTCs可能具有更强的侵袭能力，从而引起局部复发或远处转移。在本项研究中，许多患者主要表现为上皮型CTCs，尤其是那些CTC总数≥16个的患者的复发时间相对更短，这可能与上皮型CTC和混合型CTC也是EpCAM阳性CTCs有关。
9. CTCs总数多的患者具有更大的早期复发风险
我们研究结果还不能说明CTC总数高是否与某种CTC亚型所占比例之间具有明确的相关性。但我们可以解释CTC总数高的HCC患者具有更短的无肿瘤生存期。首先，CTC总数高的患者更容易出现间质型CTC所占比例高的情况，而间质型CTCs是恶性程度最高的CTC类型。同样，CTC总数高的患者也相对容易出现上皮型CTC占主导的情况，即EpCAM阳性的CTCs，如前所述，EpCAM阳性的CTCs同样代表了一种侵袭能力更强的CTCs亚型。综上所述，CTC数量更高的患者理论上具有更大的复发转移风险。因此，CTCs总数多的患者，无论是否存在间质型CTC或EpCAM阳性CTCs，他们的早期复发风险都更大。
10. 研究不足
本研究同样存在一些不足。例如肿瘤细胞可能表现出不同的大小，由于Canpatrol检测系统基于滤膜过滤的CTC分离原理，可能体积小的CTCs容易穿过屏障从而影响检测效能。为了克服此项潜在的不足，未来可能需要联合使用多种CTC检测技术以提高检测效能。此外，此研究仅对BCAT1过表达与CTC释放的相关性进行研究分析。
研究结论
- CTC存在于绝大多数HCC患者，包括早期患者
- CTC总数≥16或间质型CTC所占比例≥2％可有效预测术后早期复发
- CTC总数≥16或间质型CTC所占比例≥2％与肝内多复发灶和转移密切相关
- 术后动态监测CTC有助于提前预测HCC早期复发
- 沉默BCAT1可抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，这可能与EMT被抑制有关
- 此研究为深入了解HCC的CTCs相关分子机制提供新的信息